我们所知的形状
细胞生物学自创立以来一直就是基于视觉的科学。成纤维细胞是细长的，神经元是树突状的；有丝分裂细胞具有纺锤体，凋亡细胞具有囊泡。该领域的临床学近亲——病理学和血液学也严重依赖于细胞的形态。病理学家通过细胞偏离正常形态的多少来进行肿瘤分类，而血液学家则通过肉眼鉴定和计数不同的白细胞。
几十年来，这种视觉方法推动了许多重大发现，它们所做成的绚烂照片墙装饰了无数的实验室。但同时，传统技术的局限性也随之暴露。为了进一步推动这一领域的发展，细胞生物学家已经开始借用计算机科学中的机器学习和数据挖掘工具，而工程师们也设计出能够进行全新分析的成像和显微镜系统。
与此同时，生物学家对细胞形态学的重要性也有了进一步的认识。虽然研究人员早就知道基因和表观遗传机制可以改变细胞的形状，但最近的研究表明，反过来也说得通。如今，人们将三维培养系统、自动图像分析和复杂的微观形态映射系统结合起来，推动了一系列的突破性进展。
人群中的面孔
对于免疫学家和血液学家而言，细胞形态学研究已经稳步发展了几十年。自从最早的临床血液分析仪面世以来，基于细胞形状的自动化细胞计数就一直是医学和基础研究实验室的主要技术。人们基于细胞携带的分子标记，为荧光激活细胞分选仪增添了将细胞分离到容器内的能力。
最近，工程师们已经为其中的一些机器加入了完全成像功能和人工智能，这种系统能在一小时内同时对成千上万个细胞进行拍照和分类。“他们的目的不只是量化标记物……事实上你能定位到（这些标记），观察它们，并从细胞形状或细胞核形状中得到整体的推断。”位于马萨诸塞州比尔里卡市的Millipore Sigma公司技术及业务发展主管 Shaf Yousaf补充道，“经典流式细胞仪能做的它们都可以做到，同时还能得到单个细胞的图像。”
Millipore Sigma的系统将会产生的大量数据，这是件好事，但也有诸多麻烦。因为没有人能从成千上万的细胞图像中筛选出相关的形态差异，所以这些机器在很大程度上依赖于图像分析软件。研究人员根据购买设备的不同，可以在20~60倍的放大倍数下，在任意位置进行拍照，并使用附带的软件根据纯粹的视觉特征（例如形状和大小、荧光标记物，或二者兼具）进行分选。
自动图像分析让传统显微镜难以或无法进行的研究变为可能。一位Millipore Sigma系统的用户正在研发无标记的分析技术，区分血液肿瘤。Yousaf说，“当你观察对应着不同白血病的各类细胞形态时，你可以利用这个系统来得到统计学意义上足够多的细胞来区分不同类型的白血病。”这种同时能够跟踪细胞内外标记，并将它们映射在图像上显示细胞形状的能力，也能够帮助研究人员研究信号分子的代谢作用，如G-蛋白偶联受体。
Millipore Sigma公司的成像流式细胞仪有一系列选择，但无论是单个实验室正在购买的入门机，还是核心设施装配的更复杂的机器，研究者都应花些时间学习如何使用这些仪器。其中大部分的培训集中在实验设计和数据分析上。通常情况下，科学家会使用一组人工验证的细胞图像，“训练”软件在所需的形态学特征上的学习算法。然后，在系统上运行样品，看机器是否能够识别正确的形状，并在必要时重新训练算法。
基质之内
尽管血细胞生长在方便且易于研究的液体中，但在实验室里，大多数其它类型的细胞往往更难以分析。这就是为什么当二维细胞培养首次出现时，细胞生物学家理所当然地为之着迷。在培养皿上培养永生细胞为实验提供了前所未有的控制条件，但代价不菲。“当然，我们从这一技术中学到了很多，但同时他们也在使用全‘人工的条件’。” Mina Bissell回忆道，她是位于加州劳伦斯伯克利国家实验室生物系统和工程部的杰出科学家。
Bissell在博士后工作中注意到，从小鼠中取出乳腺细胞并将其放入培养皿中，不仅使它们失去了正常的体内形态，而且丧失了分泌乳汁的能力。“我当时说，‘嘿，我们为什么不把这些东西放在类似于基底膜的介质上呢？’” Bissell说。这个想法最终形成了一个三维的培养系统，分离出的乳腺细胞保留了它们的形状和乳汁分泌能力。从那时起，Bissell和越来越多的同事们开始接受这样一个观点：对于固体组织而言，细胞的环境和形状的重要性至少和基因一样。
“信号通路和基因表达谱在二维和三维培养下的细胞中有很大差异。” 位于加州森尼维耳的分子器件公司研究科学家Oksana Sirenko说。除了显示更多的自然信号模式外，三维培养也允许研究人员模仿活体组织相互作用的方式混合不同的细胞类型，从而提供更精确的正常生理和发病机理模型。因此，三维细胞培养系统已成为细胞生物学的一大研究重点。“三维培养正在试图弥合体内生物学和体外细胞生物学之间的鸿沟。”Sirenko说。
在典型的三维培养系统中，细胞相互依附形成球体，悬浮在液体培养基中或扩大成一个软的矩阵。当这些球体开始生长或对刺激作出响应时，研究人员可以观察到细胞形态的变化。例如，研究人员可以培养模拟早期肿瘤的球体，然后用候选的化疗方案进行治疗，并观察球体的生长停止或开始萎缩。然而，如果人工跟踪这些变化，不仅费时，而且过于主观。
“这里的挑战在于如何获得可靠的信息并在更高通量和更高可重复性的情况下进行操作——由此产生了技术。”Sirenko说。制造诸如共聚焦显微镜和平板读取器这样的高通量细胞成像设备公司，如今通过添加软件工具对三维细胞培养的图像进行处理。在典型的算法中，软件首先扫描每个图像中的球体状结构，然后定义球体内适合细胞的边界。研究人员可以通过查询数据进行评价，得出在每个平板或孔中球体内活细胞和死细胞的数目。他们还可以追踪针对线粒体、细胞核和其它亚细胞结构的标准分子标记。“你不仅可以评估变化，例如正在死亡的细胞，而且也可以看到在不同条件下更加细微的表型变化。”Sirenko补充道。
分子器件公司将这类软件融入高通量筛选平台，因此科学家们可以快速扫描在不同培养条件下生长出的数千个球体。该系统可以产生候选药物的剂量—反应曲线，筛选大量基因突变的表型，或为全新的实验执行复杂的自定义方案。尽管它十分依赖于自动化，不过，Sirenko强调，研究人员还是保留了手动评估细胞的功能：“我可以检查任何编号或整个平板，观察它是否与我的视觉评估一致。”其它公司也在他们自己的高通量筛选平台上提供此类工具，例如GE医疗365bet公司的细胞分析仪系统。
制药公司是高通量细胞形态学设备的主要市场，但如今，激烈的竞争和迅速增长的计算能力已经降低了设备的价格，使得许多学术用户也能负担得起。Sirenko估计，基础研究实验室目前占据了这些系统一半的用户。
一看便知
在三维细胞培养过程中，自动化形态学分析的功能是十分强大的工具，但是一些科学家还在向前进一步推动这项技术，其中一些算法可以对动物活体和临床标本进行结构分类。这些分析长期依赖于细胞形态的质变来跟踪生理变化。例如，神经生物学家可以基于它们的形状跟踪小胶质细胞的激活、大脑中的天然免疫细胞。“几十年来，众所周知这些活化的小胶质细胞收缩了分枝的丝状伪足，并成为圆的。”加州南旧金山基因泰克的科学家Cleo Kozlowski解释说。
然而，这种检测并不能精确定位到激活的时刻，也不能直观地量化小胶质细胞激活和基因表达模式之间的联系。Kozlowski通过计算解决了这个问题；采用流行的MATLAB编程环境，她和同事们开发了一种算法，能够对共聚焦显微镜图像中的小胶质细胞形态进行分类，精确度达90%。这项技术在切片的脑组织中以及在活鼠的大脑（它们的颅骨中植入了透明头骨）中都可以起作用。该算法通过量化细胞的形状，让研究人员可以精确地确定它们的激活途径。将这些信息叠加到基因表达谱的数据上，能够使小胶质细胞拥有前所未有的精确性。Kozlowski说，自2012年该技术问世以来，她已经应要求为众多研究人员提供了代码。
最近，Kozlowski一直专注于诊断结肠炎。“结肠炎一般是由病理学家进行评估的，所以他们必须坐下来，在显微镜下看看各个领域，并评估肠道中炎症和隐窝的形态变化有多严重。”Kozlowski补充道，“我只是想加快这一进程。”
病理学家通常使用苏木精和曙红（H&E）染色来突出肠道结构。不幸的是，计算机很难解释这种类型的染色。“它不会染色你感兴趣的特异性分子——它所提供的是组织结构的概述，所以它主要是有关形态和形状。”Kozlowski说。她将荧光显微镜与在夜空的图像中搜索星星作对比，而使用H&E更像是在谷歌地图上分辨出城市，计算难度更大。
为了能够进行分析，Kozlowski和她的同事们在德国慕尼黑Definiens公司强大的专有图像处理框架中建立了自己的算法。所获得的系统可以快速、准确地区分健康的小肠和结肠炎，但其价格只有实力雄厚的企业研究人员才能负担得起——Definiens公司的许可证对于绝大多数实验室来说价格过高。
然而，自动化病理学检测的主要挑战可能来自于文化。“这将是最大的障碍，真正去说服那些并不相信机器能够做到这种事的人，让他们说出，‘噢，它可以做到’。”Kozlowski解释说。
观察与感知
除了设计出分析常规细胞图像的独特方式外，研究人员也在利用新的显微镜技术去更好地定义细胞形状。原子力显微镜（AFM）技术利用硅探针扫描表面，并构建它所遇到的细胞的三维图像，就像有人用手指阅读地形图一样。原子力显微镜特别适用于识别细胞骨架的变化，研究骨骼等相对坚硬的表面。
然而，对于软细胞而言，原子力显微镜只能产生模糊的图像。“观察活细胞膜几乎是不可能的，因为细胞膜的结构并不简单，它有许多糖蛋白和细胞外基质。”位于韩国水原市Park Systems 公司的首席科学家与研发主管Sang-Joon Cho解释说。硅探针在测量软细胞时会挤压软细胞的膜，改变了多个结构，是细胞生物学家最感兴趣见到的。
为了解决这个问题，Cho和同事们将目光转向扫描离子电导显微镜（SICM）。扫描离子电导显微镜区别于固体硅探针，它是通过一个薄的毛细管喷射一连串的盐溶液。通过测量施加在盐水中的电压偏差的变化，揭示了毛细管与细胞之间的紧密程度，从而使研究人员能够在不破坏细胞表面的情况下扫描上面的细微结构。
对于Cho来说，结果是具有启示性的。通过比较胚胎干细胞的原子力显微镜与扫描离子电导显微镜图像，他发现后者能够显示出在原子力显微镜下显示不出的内容。“原子力显微镜没有捕捉到细胞表面微绒毛和其它结构的细节。”Cho补充道，“如果我们采用了这项技术，我们实际上可以为细胞生物学打开一个新的篇章。”
Park公司的扫描离子电导显微镜系统也内置了原子力显微镜和光学显微镜，因此科学家可以利用这3种技术对细胞进行观测，并且比较或叠加所产生的图像。该系统还可以增强其它技术，如电生理学中的膜片钳方法。调查人员可以利用扫描离子电导显微镜在细胞膜上选择一个特定的点，然后用膜片钳来测量膜电位。他们还可以向细胞的靶点输送精确剂量的药物、核酸或蛋白质。
原子力显微镜与扫描离子电导显微镜都需要专业的训练，但大多数生物学家发现后者的仪器更容易掌握。“当我培训的时候，他们需要几个月的时间才能利用原子力显微镜获得软生物样品的一些图像，但扫描离子电导显微镜只需一个星期就能完成。”Cho说。
无论他们采取什么样的方法，细胞形态学的专家一致认为，该领域正在蓄势待发，实现巨大的飞跃。“对我来说，前进的两个关键点是机器学习和更好的光学系统。”Kozlowski补充道，“这对图像分析而言是一个激动人心的时刻。”■
（译者之一高大海是365体育手机版：海洋研究所助理研究员。）
Alan Dove 是马萨诸塞州的科学作者和编辑。
DOI: 10.1126/science.opms.p1600110