作者:Jeffrey M. Perkel / 文 高大海 姜天海 / 译 来源: 发布时间:2017-4-21 20:3:37
膜信使——胞外囊泡

 
2007年,哈佛医学院汉德拉·布雷克菲尔德实验室的一名新博士后Johan Skog,试图培养一位神经外科医生给他的新鲜人胶质母细胞瘤组织活检材料。当他把细胞培养物放在光学显微镜中观察时,Breakefield回忆说,“它们是我们所见过的最奇怪的细胞,被一些突起物覆盖着。我们当时在想,‘这到底是什么?’”
 
原来, “这”就是囊泡。大量的囊泡,有些直径达半微米。在电子显微镜下,细胞实际上排出了更小得多的颗粒——一天内多达10000个,Breakefield说。
 
胞外囊泡(EVs),是由细胞分泌到循环系统的膜封装包,存在于所有的体液中,直径可以大到2微米,小的只有50纳米;外泌体是一种囊泡亚型,已经过研究人员的大量研究,直径范围是50到150 纳米。研究人员在多年前已经意识到它们的存在。但直到21世纪头十年中期,它们在很大程度上被看作是细胞碎片,或者是有趣的蛋白信号的载体,一直为人所忽略。Skog回忆说,这对他来说很奇怪。“我当时看着这些囊泡就在想,‘如果它们不能包含RNA,那就太奇怪了。’”
 
结果如他所料:囊泡被塞满了反映原发肿瘤突变状态的RNA。同样重要的是,这些RNA可以作为胞内信使,诱导受体细胞改变它们的行为。例如,将纯化的胶质母细胞瘤的囊泡加入到培养的内皮细胞中,它们开始形成血管,或开始血管生成,Breakefield说。“它们就在你面前形成了小管。”
 
“瓶中信”
 
如今,像Breakefield和Skog(她完成博士后之后成立了一家致力于此项新科学研究的公司,称为外泌体诊断)这样的研究人员,正在努力理清胞外囊泡的生物学特性,并将这些信息转化为临床应用。他们获得了一些令人兴奋的观察资料。例如,胞外囊泡内容物并不一定与产生它们的细胞的内容物相匹配。
 
“它们就像是漂流瓶中的信息。”位于澳大利亚墨尔本的拉特巴大学生物化学和遗传学系的Andrew Hill说。他也是国际胞外囊泡学会(ISEV)的候任主席。
 
这个研究团体最终引起了重视。在PubMed中,近4600篇发表文献包括关键词“外泌体”,其中4200篇是2006年之后发表的。2013年,美国国立卫生研究院(NIH)推出了由共同基金资助的胞外RNA通讯联盟(ERCC)。俄勒冈健康与科学大学麻醉与术前医学系副教授Julie Saugstad得到了ERCC的资助,她指出,ISEV年会的参会者已经从2011年成立大会上的数百名增长到数千名。“这就像每个人有一天醒了突然说,‘哦,天啊,这些都太酷了。’它们是很酷。”她对此表示同意。但这并不意味着它们的研究也很容易。
 
一种方法无法“包打天下”
 
乌得勒支大学生物化学和细胞生物学助理教授Esther Nolte-’t Hoen从研究生起,就一直在研究胞外囊泡。当时,从体液分离(或者说富集)胞外囊泡要通过差速离心法或基于密度的分馏法。她指出,这些技术在今天仍然得到广泛的应用,但对于非专业人员来说,这些方法也不那么实用。此外,它们不能被用来纯化具有不同分子构成和功能的囊泡亚群。
 
最近,研究人员的“工具箱”中又多了一种方法——分子排阻色谱法(SEC),这种方法具有多种的商业可能。其中包括赛默飞世尔科技公司的总外泌体分离试剂盒,该方法通过沉淀法重新获得外泌体;以及来自Exosome Diagnostics公司的exoRNeasy血清/血浆试剂盒(由Qiagen公司推向市场),该方法依赖于离心柱。
 
赛默飞世尔科技公司研发部高级经理Alexander “Sasha” Vlassov指出,所有这些方法的局限性在于,它们不特定针对某一类囊泡。细胞会分泌“至少10种不同类型的纳米囊泡,但很难或不可能依据相似的大小、密度和表面标记物来区分这些囊泡”。
 
至少有部分囊泡的功能可能实际上是由自由的核糖核蛋白复合物所决定的,它们也往往会与囊泡共同被纯化。而且所有这些不同的实体(无论是不是膜封闭的)都可能通过不同的途径形成,携带不同的内含物,并执行不同的功能。打个比方,外泌体是通过胞内通路产生的,它们是在细胞内形成的。相比之下,一些较大的囊泡则像病毒一样,从细胞的表面生长出来。
 
蛋白质的力量
 
自然而然地,研究人员也正在努力鉴定能够帮助区分这些不同囊泡的蛋白标记物。Clotilde Théry是法国巴黎居里研究院和法国国家健康与医学研究院(INSERM)的课题组长,以她为例,她最近使用液相色谱—质谱法探测不同囊泡碎片的蛋白质含量。她的分析发现,至少有六种不同的囊泡类:大、中、小型胞外囊泡(可由离心法区分出来),而后者又可以基于蛋白质标记(包括一般的蛋白标记CD9、 CD63和CD81)进一步细分为四种亚类。
 
当然,癌细胞会产生独特的蛋白构成,研究人员对于找到能够标记肿瘤衍生囊泡的蛋白质尤其感兴趣。在此类研究的一项近期案例中,位于休斯敦的德克萨斯大学MD安德森癌症中心的癌症生物学系主任Raghu Kalluri教授和他的同事鉴定出了磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(GPC1),作为胰腺癌特异性囊泡标记。(Kalluri共同创立了Codiak Biosciences公司并持有其股份,该公司致力于利用外泌体来进行各类疾病的诊断和治疗)。GPC1阳性囊泡似乎具有成倍的信息,Kalluri说,GPC1阳性囊泡的数量是与疾病的严重程度相对应的,而使用定量聚合酶链式反应(qPCR)进行囊泡RNA的遗传分析可以揭示肿瘤的突变状态。
 
同样,Exosome Sciences公司的科学家近期在一项对78名前职业足球运动员的研究中表明,在神经tau蛋白中富集的胞外囊泡(该公司将其称之为“TauSomes”)在慢性创伤性脑病变的运动员体内有所提高,目前这种神经系统疾病尚不能得到死前的明确诊断。
 
不走寻常路
 
尽管许多学者对胞外囊泡的研究差不多,但加利福尼亚州圣地亚哥Scintillon研究所的John Nolan教授却更喜欢另一种不同的方法。
 
就像细胞具有不同的蛋白和基因表达特性,它们分泌的囊泡也是如此。Nolan说,找到这一差异的唯一途径是要逐个分析这些粒子。他选择的方法是:流式细胞仪。
 
让流式细胞仪适应纳米尺寸的囊泡并不容易,Nolan指出。一个10微米的细胞表面可能会有多达10万份丰富蛋白质的拷贝,即使是低丰度的蛋白也有几千份的拷贝。但是,检测100纳米直径的胞外囊泡比之要小100倍,表面积少了1万倍和体积小了100万倍,因此,抗体能够捕获的蛋白也少得多。
 
Nolan和他的团队已经开发出能够最大化光源产生和检测的定制仪器,并将该仪器与超亮荧光、协议和校准用标准都结合在一起。“我们对光源、流动室、探测器和光的收集方式都做了一系列的改变,合起来能够将性能提高50%到200%。”他解释说。
 
Nolan使用该系统在大鼠血浆中量化结合了特定标记物(CD61和膜联蛋白V)的囊泡。他还可以基于尺寸区分这些颗粒,因为将胞外囊泡与一种膜结合染料di-8-ANEPPS混合后,会产生一种与膜表面积成比例的信号。
 
据Nolan说,例如Beckman Coulter公司的CytoFLEX等的一些商业化系统现在已经上线,它们也具有囊泡分析所需的荧光灵敏度。这也会使该技术能够被更广泛的研究团体所接受,Nolan说。但他也指出,要想作为疾病的生物标志物来解析囊泡,仍然面临着一些挑战:没有人知道正常的囊泡分布是什么样的。
 
尽管如此,研究人员也在继续锐意进取。例如,Nolte-’t Hoen和她的同事们已经开始使用一种改进的BD Biosciences Influx系统,对肥大细胞中衍生的囊泡进行分选。通过对CD9或CD63使用抗体,他们证明了一些囊泡中含有某种蛋白,另一些囊泡则含有其他的蛋白。“我们认为这可能与它们的生物合成途径有关,它们来自于细胞的不同部分。”她说。
 
此外,目前也尚不清楚这两个囊泡类型是否执行不同的功能。而这可能并不容易判断,Nolte-’t Hoen说,“当然,因为目前你有一个抗体是连接到你的囊泡上,这可能会影响到功能。”为了规避这个问题,她目前正在研究“负分选”策略,也就是囊泡的富集是基于它们不包含的蛋白。
 
液体活检
 
尽管在基础囊泡生物学中还存在着巨大的知识缺口,许多研究人员的目光都聚焦在其它地方,特别是胞外囊泡的临床潜力。
 
例如,许多在诊断一线的研究人员在追求所谓的“液体活检”。临床医生不选择通过实体瘤活检或非侵入性成像来对疾病(尤其是癌症)进行诊断、分期和监测,理论上来讲,他们可以从血液、尿液和其它体液(例如外周肿瘤细胞、外周肿瘤DNA和外泌体)中提取出相似信息。
 
例如, Exosome Diagnostics公司的ExoDxLung(ALK)测定法使用实时定量PCR来分析来自血浆的EML4-ALK基因融合片段,这是一种对激酶抑制剂crizotinib敏感的遗传标记。在《JAMA肿瘤学》杂志发表的一项近期研究表明,该公司的前列腺癌检测法(尚未进行商业推广)同样可以基于三个基因的表达来对患者进行高低风险的分类。
 
Caris365bet公司是一家聚焦于胞外囊泡“分子分析”的公司,该公司的研究人员使用一种称为“ADAPT(自适应动态人工聚配体定位)”的负结合技术,以确定疾病的蛋白质特征标记,该公司的首席科学家David Spetzler表示。最近,该公司使用来自500个患者样本的2000肽文库,开发了能够比乳房摄影术更好地在致密的乳房组织中检测出癌症的特征标记。
 
同样,Saugstad通过研究脑脊髓液(CSF)的RNA含量,确定了阿尔茨海默病的一个潜在特征标记。从756个已知的人微小RNA(miRNA)中,她的团队鉴定出36个miRNA,它们在脑脊液中的丰度似乎与疾病相关联。鉴于miRNA属于非编码的调控分子,这些信息能够识别出参与病理生理学的新蛋白质,她说。
 
在波士顿,麻省总医院系统生物学中心的生物医学工程项目主任Hakho Lee正在采取另一种方式来进行外泌体诊断:微流体技术。
 
多年来,Lee基于多种原理开发了包括电化学检测、磁学、声学等在内的液体活检分析工具。他说,目前他所采用的最先进技术利用到了表面等离子体共振技术(SPR)。
 
SPR是一种相当成熟的技术,已被Biacore公司(现属于GE Healthcare公司的一部分)等进行了商业化,用于量化蛋白—蛋白与蛋白—配体的相互作用。为了产生SPR,抗体被固定到棱镜顶上的金薄片上。光穿过棱镜后,以确定的角度从金薄片的底部反弹回来。由于分子是结合在金传感器的反面,这个角度的变化会与结合的程度成比例,因此能够实时读出分子相互作用的程度。
 
在Lee的技术版本中,抗体被点样在位于“周期性纳米孔阵列”上的微金传感器上,随后被安置在微流体芯片上。当囊泡结合到这些传感器时,它们的光谱响应与结合程度之间发生了成比例的变化。最好的一点在于,测定的囊泡随后可以被纯化,用于下游的遗传或蛋白质分析。
 
Lee表示,该系统具有极强的扩展性。比如,在一项原理论证研究中,他的实验室研制出一种“纳米等离子外泌体”(nPLEX)传感器,具有1089个检测位点。从卵巢癌细胞系表达的71个蛋白的文库中,他们鉴定了一组双蛋白外泌体标记,随后用于20个癌症和10个对照目标中。Lee注意到,在nPLEX分析中,这一特征标记对治疗反应进行了追踪。在产生治疗响应的患者体内,该标记表达下降;而在不响应的患者中,表达上升。
 
具有疗效的外泌体
 
研究人员也在探索将外泌体作为提供治疗的载体。西北大学化学与生物工程系副教授Joshua Leonard说,胞外囊泡似乎展现出一些特性(尤其是低毒性),这让研究人员难以从合成囊泡中获得。
 
例如,研究人员可以使用电穿孔将特定内含物加载到胞外囊泡中,或通过在胞外囊泡产生的细胞中表达核酸。2011年,牛津大学的Matthew Wood和同事们同时使用这两种方法展示,他们可以通过外泌体来下调小鼠大脑中的神经元基因表达,这是通过向外泌体中加载神经元靶向肽和特定的短干扰RNAs。Leonard说,这一结果表明胞外囊泡可以克服至少三个重大的障碍:穿过血脑屏障,专门加载神经元,并成功地交付细胞中的内容物。
 
最近,Leonard的研究小组中,由研究生Michelle Hung负责,开始梳理指导胞外囊泡中RNA加载的规则。该团队将一种外泌体蛋白与一种通常参与到传递核酸至病毒中的噬菌体蛋白相融合,并将这个蛋白质的信号序列发夹结构配到不同长度的RNA中,从而监控哪些RNA会在所得粒子中消亡。他们发现,尽管较长的RNA和信使RNA的加载效率往往不那么高,但所有的RNA都能被加载上。“我们试图完成胞外囊泡加载规则的量化地图的第一遍。”他解释道。
 
当然,将这些观察转化为临床实践将需要相当大的努力。但考虑到研究界的参与程度,大家都期待这些进展能够宜早不宜迟。“就好像这里有一种语言,而我们(刚刚)处在开始了解字母表的水平。”Breakefield承认,“我们还不懂语法,我们也不知道何时,因为什么,谁在跟谁说话。但我们正在把它搞清楚。”■
 
(译者之一高大海系365体育手机版:海洋研究所助理研究员)
 
Jeffrey M. Perkel是位于爱达荷州波卡特洛市的科学自由撰稿人。
DOI: 10.1126/science.opms.p1600106
鸣谢:“原文由美国科学促进会(www.aaas.org)发布在2016年6月9日《科学》杂志”。官方英文版请见http://www.sciencemag.org/custom-publishing/technology-features/membrane-messengers-extracellular-vesicles。
 
《科学新闻》 (科学新闻2017年3月刊 科学·生命)
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