1983年5月，当时还在加州埃默里维尔的Cetus 公司担任研发人员的Kary Mullis合成了一些寡核酸片段，随后将它们与少量的模板DNA混合，并加入一种聚合酶及其他试剂。经过一系列的孵育后，正如Mullis所愿，聚合酶已经通过一个链式反应将模板复制了许多次。
Mullis最终脱离了科学主流，Cetus经历了一系列并购，但PCR依然存在。就像它靶向的DNA模板不断扩展，PCR技术已经被复制、扩增并传播到世界各地的实验室。专用的热循环仪和相关工具席卷市场，供应商出售各种各样的热稳定聚合酶，世界各地的大学生在生物学入门课程中学习这项技术。
PCR已经有35年的历史了，它已经成为一种无处不在的实验室工具。尽管如此，研究人员、工程师和医生仍在努力寻找将其推向新领域的方法。从这些努力中的一些案例上可以看出，PCR的应用范围已经扩大到空前的程度，从奶牛场到诊所，从教室到外太空。
发射出去的序列
PCR所需的主要硬件是热循环仪，这是一种能够快速加热和冷却样品管的机器，并能在特定的时间内将样品管保持在精确的温度。尽管三十年的发展和竞争极大地改进了这些机器，但它们仍然相对笨重、耗电和昂贵。因此，作为现代分子生物学的一项关键性技术，PCR仍然无法为一些教育工作者所使用，在许多偏远地区也无法使用。
“PCR是最重要的研究技术之一，但因为设备的规模和成本，它也是最受限制的技术之一。尤其当你在实验室之外时，”位于马萨诸塞州坎布里奇的MiniPCR公司的遗传学专家和共同创始人Zeke Alvarez-Saavedra这样说。传统的PCR仪不便移动，出于对这一特点的失望，2013年，Alvarez-Saavedra与分子神经生物学专家Sebastian Kraves合作，研制了一种便携式热循环仪。
大多数热循环仪使用Peltier结来控制温度，Peltier结是一种能够在加热和冷却之间快速切换的热电装置。不幸的是，Peltier结效率低下，操作这些结点所需的元件使热循环仪变得笨重且耗电量大。
Alvarez-Saavedra和Kraves采用了不同的方法，他们使用一种薄膜电阻加热器加热样品，类似于汽车上常见的车窗除霜器。为了冷却，团队使用了一个简单的风扇。微控制器驱动加热、冷却和孵育周期。更简单的设计使得机器比普通的热循环仪更小更轻，也带来了其他好处。“当你把东西做的更小，它的零件更少，且耗电更少……这有助于降低成本，” Alvarez-Saavedra说。
正如他们所希望的，低成本的小型PCR系统立即吸引了学校客户。Kraves说：“在我们成为科研人员的过程中，直到读完高中还没有接触过生物技术，这对我们来说是一种痛苦，所以我们想要消除一些障碍。” 公司还开发了一种小型、简单的琼脂糖凝胶电泳系统作为配套产品。一个包含热循环仪、凝胶系统和配件的完整的工具包只卖不到1000美元，将它控制在了许多学校的预算之内。
尽管学校已经成为MiniPCR的主要市场，其他行业也迅速采用了这一平台。Kraves说，野外研究人员、动物育种专家和食品公司都逐渐采用了这个系统，他们发现，在现场进行自己的PCR检测，要比把样品送到远程实验室更便宜，也更快捷。
然而，最令人惊讶的电话来自国际空间站上的工程师。“我们从来没有专门要把这项技术设计成太空友好型的，所以当太空机构告诉我们它非常适合太空飞行时，我们感到特别惊讶，” Kraves说。MiniPCR系统现在是竞赛“太空中的基因”的核心组成部分，中学生们提出基于PCR的实验，然后由空间站上的宇航员在微重力环境下进行。
智能手机上的PCR
MiniPCR是第一家将PCR应用于太空的公司，但他们并不是唯一一家试图使这项技术更便宜、更便携的公司。韩国首尔的Ahram Biosystems在销售的Palm PCR微型化热循环仪，类似于MiniPCR装置。与此同时，位于宾夕法尼亚州费城的Biomeme公司将便携式PCR的理念提升到了一个新的高度，将其扩展到实时PCR。
在实时或定量PCR（qPCR）中，实验人员使用荧光标记物连续监测PCR扩增的进展。通过测量新的DNA拷贝出现的速率，研究人员可以计算出初始样本中有多少模板分子。他们也可以直接从PCR反应管中读取结果，而不需要琼脂糖凝胶电泳。然而，所有这些监测和计算都需要大量的计算能力和额外的设备，使得qPCR比标准PCR更加复杂和昂贵。
Biomeme公司的联合创始人Marc DeJohn、Jesse van Westrienen和Max Perelman认为，一种不相关的趋势可能有助于让qPCR走出实验室。van Westrienen说：“我们想到，每个人口袋里都有一部智能手机，但却从没见过他们用它来做分子诊断。”在解决与MiniPCR公司同样面临的热循环仪工程问题时，Biomeme公司还解决了通过智能手机应用程序添加光学传感器的难题，该应用程序既可以控制和监控qPCR反应，也可以用于对样品制备所需的耐贮存试剂的管理。
对于现场使用来说，“准备样本可以说是最困难的事情，我们从一开始就致力于开发一种非常简单的产品，不需要任何专业知识或特殊的实验室设备。” van Westrienen这样介绍。结果是一个针对不同应用的试剂盒目录，每个试剂盒都有冻干试剂和在样管中预先测量的引物。
Perelman说，通过使用该公司的相应试剂盒，一个受过最低限度培训的实验人员可以在几分钟内将一份原始样品制备成一套qPCR反应样品，为热循环做好准备。这台机器本身有一个与标准智能手机连接器兼容的基座。Biomeme公司基于网络的数据端口可以存储由此产生的原始数据，研究人员可以在线分析这些数据或将其下载到自己的电脑上。
目前的Biomeme系统售价4000美元，比MiniPCR的系统贵很多，但是Perelman认为它提供了额外的功能：“你可以在一个小时内完成所有的工作，只需在应用程序中向左或向右滑动，就能实时看到扩增的效果。”Perelman还补充说，该公司目前正在与国防和执法部门的用户，以及野外作业科研人员和食品公司合作。
快的和死的
虽然便携式PCR技术正在迅速扩大其应用范围，但世界各地的研究人员仍在以无数渐进的方式推进其能力的拓展。区分活细菌和死细菌的问题为此提供了一个很好的例子。
PCR对于检测核酸序列是非常敏感和特异的，但是仅仅知道一个特定的DNA或RNA序列存在，并不能证明它与一个活的生物体有关。这是食品工业的一个主要问题，是否巴氏灭菌的食品中都会通过PCR检测出病原菌阳性，尽管前者的细菌是安全的死亡的，而后者的细菌是危险的存活的。因此，食品实验室长期以来依赖于相对缓慢、繁琐的培养试验来进行最终检测。
开发出只能进入死细菌的DNA交联剂是该领域的第一个重大进展。交联可以防止死细菌的DNA在随后的PCR反应中被扩增。第一代试剂使用很不方便，需要暗室和冷库。最近，日本奈川县森永乳业的Takashi Soejima和他的同事开发出了一种稳定、耐光的化合物，同样以死细菌为目标。该团队最近的工作涉及钯基试剂，这些试剂选择性地干扰了来自死亡而非活细菌的DNA通过PCR扩增。将钯试剂与qPCR相结合，产生了一种可以取代旧的、更昂贵的技术，简化了乳制品和其他食品设施生产的测试方法(1)。
用于癌症诊断的液滴
研究人员和设备制造商也借鉴其他领域的技术，对PCR进行了更彻底的修改。其中一项成果是液滴数字PCR（ddPCR），它结合了荧光活化细胞分类技术（FACS）和传统PCR的各个方面。虽然ddPCR的实验流程有些复杂，但它已经变得高度自动化。事实上，加州赫拉克勒斯的伯乐公司现在可以销售完整的ddPCR设备，可以自动运行整个过程。在这些系统中，喷雾器将制备好的PCR反应混合液分离成数千个纳米级的液滴，然后在热循环过程中保持液滴的独立。每个液滴都进行自己的一系列扩增，然后机器用荧光标记对其进行分类，以检测目标序列。
ddPCR已被证明特别适用于检测背景水平（非靶标DNA）非常高的样本中的微量靶标，如在患者血液样本中循环的肿瘤DNA标志物。这项技术已经相当稳定。至少，位于科罗拉多州博尔德的Biodesix公司，现在已经提供基于ddPCR的“液体活检”临床测试。Biodesix测试使用一个小血样，可以快速识别肺癌患者肿瘤中的精确突变，让医生能够为该肿瘤类型选择最有效的药物。
“一旦我们知道了确切的突变，就可能借助靶向疗法来治疗，这改变了我们治疗病人的整个模式，”位于北卡罗莱纳州格林维尔的东卡罗莱纳大学临床肿瘤学教授Mark Bowling说（他是该校的保罗. R.和凯瑟琳. M.赫廷格·沃克杰出教授）。虽然传统的活检分析和测序可以得到相同的信息，但Biodesix测试要快得多。“我们可以在三天内得到测试结果，”Bowling说。标准的活检可能需要两周以上的时间。Bowling说，对于那些能对靶向治疗产生响应的肿瘤患者来说，可能是生与死的区别。
由于Biodesix是基于PCR技术，因此随着制药商推出更多的基因靶向疗法，Biodesix测试的应用范围还有扩大的空间。然而Bowling说，即使目前靶向化疗药物的选择有限，知道病人确切的肿瘤类型，在三分之一的情况下已经改变了他们团队的治疗策略。
建立一个更好的循环
临床试验一直是PCR开发人员关注的重点，但有时这种技术的要求阻碍了它的发展。在第一份描述Mullis版本 PCR技术原理验证的出版物上，作者展示了如何使用它来识别导致镰刀型细胞特征的血红蛋白突变(2)。不幸的是，镰刀型细胞贫血症流行的地区在撒哈拉以南的非洲，对于那里的许多临床实验室来说，PCR仍然过于昂贵。
即使PCR技术不断拓展到新的领域，总有些限制促使大量研究人员开发替代它的核酸扩增技术。这些方法中的大部分都遵循类似的原理，但具备了不同的优势。利用一种高速率聚合酶的多重置换扩增，已成为基因组测序的标准技术。而滚圈扩增则能够将目标序列反复复制到一条单链DNA上，在生物化学中得到了广泛的应用。
与此同时，环介导的等温扩增技术（LAMP）已经成为想要在野外环境里进行DNA测试的研究人员的热门选择。顾名思义，LAMP使用一种可以在恒定温度下打开并重复复制DNA分子的聚合酶，因此无需昂贵的热循环仪。
这对像比利时列日的LaCAR MDxTechnologies这样的公司很有吸引力。该公司正试图开发适用于欠发达国家的临床检测技术。“我们就是在寻找一种使分子遗传学检测更容易的方法。你可以使用一些色谱柱或者PCR设备，但是你需要昂贵的材料和复杂的技术。” LaCAR的首席执行官Arnaud Allaer说。
该公司转而开始采用LAMP技术，并很快发现它非常强大。除了不使用热循环仪，该公司基于LAMP的检测方法还可以鉴定来自新鲜或冻存血液样本中的基因点突变，甚至是吸墨纸上的干血斑，而不需要DNA提取步骤。终于实现了最初PCR论文的承诺，LaCAR根据他们的发现开发了一种廉价、可靠的镰刀型细胞特性测试方法。Allaer说:“我们在列日大学做了一个临床试验，我们也将在刚果做一个。”（3）
无论他们是在制造便携式热循环仪，使用先进的PCR检测技术快速诊断癌症，还是探索其他技术来突破PCR的局限性，该领域的专家都对未来35年的DNA扩增技术发展持乐观态度。“这是一个激动人心的时代，”Bowling说。■
参考文献：
1. T. Soejima, K. Iwatsuki, Appl. Environ. Microbiol. 82, 6930-6941 (2016).
2. R. K. Saiki et al., Science 230, 1350-1354 (1985).
3. L. Detemmerman, S. Olivier, V. Bours, F. Boemer, Hematology 23, 181-186 (2018).
（译者李楠是365体育手机版：深圳先进技术研究院的副研究员。）
Alan Dove是常驻马萨诸塞州的科学作家和编辑。
鸣谢：“原文由美国科学促进会（www.aaas.org）发布在365bet：5月10日《科学》杂志”。官方英文版请见https://www.sciencemag.org/features/2018/05/pcr-thirty-five-years-and-counting。
《科学新闻》 (科学新闻2019年6月刊 科学·职业)