CRISPR/Cas9系统等基因组编辑工具的出现，为科学家提供了一种成本低廉、易于获取、且相对简单的改变基因的方法。通过结构和翻译后修饰来精确控制蛋白表达，在表达治疗性蛋白（如处方药）方面同样十分重要。而控制其他物种（如蚊子）的蛋白质表达，甚至可能有助于研究人员根除疟疾、寨卡病毒和西尼罗河病毒、登革热以及其他由蚊子传播的疾病。
快速发展的分子工具有着深远的影响，CRISPR的广泛应用已经证明了这一点，加州大学伯克利分校分子细胞生物学和生物化学系教授Jamie Cate表示。他说:“CRISPR系统是神奇的资源，可以帮我们发现操纵RNA和DNA的新工具，我把现阶段生物学的发展看作是计算机领域的晶体管革命。”
其他分子工具也在发展，有时还与CRISPR系统相互配合，以拓宽应用范围，增强蛋白质表达控制的效力和多功能性。例如，人工酶正在摆脱它们的局限性，获得可编程能力。分子开关正变得多面化，能够进行更多的微调操作。新一代的蛋白表达系统可以带来比以往任何时候都多的复杂生物疗法。有一件事是肯定的，随着分子控制手段变得越来越复杂，它们的用途也在不断扩展。
靶向DNA和RNA的人工酶
尽管CRISPR/Cas9是一种强大的工具，但该系统偶尔也有缺陷。其中一个是需要基序 （PAM）序列恰好位于预期编辑位点的上游。PAM序列是Cas9酶的结合信号，所以它的存在是必要的，但同时也是一个限制（如果在所需编辑位点的上游不存在PAM序列，则需要创建一个）。伊利诺伊大学厄巴纳—香槟分校Carl R. Woese基因组生物学研究所生物系统设计研究组负责人赵惠民正在开发一种类似CRISPR的基因组编辑工具，以消除这种限制，并通过绕过PAM序列进行编辑来提高系统的通用性。
赵惠民的实验室开发了一种基于PfAgo的人工限制性内切酶（ARE）系统，其中PfAgo是一种来自于原核微生物（单细胞）古火球菌的Argonaute蛋白。这个平台超越了传统的II型限制性内切酶，即可以在预定的位点上切割DNA的 “分子剪刀”(1)。
“我们可以很容易地创造无数种人工限制性内切酶，它们具有所需的序列特异性，并产生确定的不同长度的粘性末端。这个简单的系统由一个蛋白质PfAgo和两个针对特定双链DNA序列的向导DNA组成，”赵惠民说。“这个系统可以多路复用，因为同一个蛋白质可以装载多个向导DNA，同时定位多个位点。”
因为向导DNA指示PfAgo在哪里切割，通过编程可以使系统切割几乎任何地方。另一个优点是PfAgo的识别序列（通常是16个碱基对）比传统的限制性内切酶（通常识别4到8个碱基对）更长;识别序列越长，越容易找到独特的切割位点。与以前的人工限制性内切酶不同，PfAgo在切割DNA时可以产生特定而且较长的粘性末端，这有助于随后将DNA片段连接在一起。
赵惠民的实验室渴望应用这项新技术。他说:“我们还开发了一种基于PfAgo/ARE的直接克隆方法，用于克隆大型的天然产物生物合成基因簇，以发现新的天然产物，这些产物有可能被用作抗生素和抗癌药物。”他新成立的Modular Bioscience公司将探索PfAgo在医学诊断中的应用，如液体活检、或者单核苷酸多态性和病原体的检测等。
另一种与CRISPR相关的Argonaute蛋白来自Marinitoga piezophila （MpAgo）细菌，是Cate实验室的研究重点，该实验室主要研究蛋白质的翻译机制和调控(2)。“我们的目标是制造一种RNA靶向技术，我们可以用它来探索人类细胞中的RNA生物学，” Cate说。他们想要利用RNA引导的蛋白质来定位RNA，作为用共价键标记RNA的替代方法。
Cate团队的一名成员、博士后研究员Audrey Lapinaite发现，主要的挑战是“如何将向导RNA装入细胞内的MpAgo”，Cate说。她解决了这个问题，在体外组装了向导RNA-蛋白复合物（RNPs），然后在细胞实验中使用RNPs。Lapinaite发现，对向导RNA的5’-核苷酸进行修饰后，可以生成易于编程的RNPs，其与完全互补的RNA靶标具有很高的亲和力。此外，经修饰的RNPs具有较高的特异性，可以区分仅有一个核苷酸差异的RNA底物。
Cate对使用MpAgo RNPs操纵RNA的前景感到兴奋。他说:“我们最希望利用MpAgo在人类细胞中定位RNA，用类似成像和蛋白质组学实验来探索人类RNA生物学。”因为MpAgo来源于细菌，所以它不太可能用于治疗目的。但是Cate希望利用这个系统来深入了解内源性的人类Argonautes是如何工作的。
分子开关
鉴于CRISPR/Cas9基因组编辑的强大功能，研究人员正在寻找使该系统可诱导启动的方法，以便在特定时间打开或关闭编辑功能。一个由卡迪夫大学的Yu-Hsuan Tsai和巴斯大学的Anthony Perry领导的英国合作团队开发了一种新型的诱导CRISPR开关(3)。之前的开关有一系列的缺点,如在没有信号的情况下，泄漏产生编辑活性，或依赖于抗生素的使用，从而增加抗生素耐药性的风险等。“我们设想使用一种人工的、非生理的氨基酸来解决这些问题，”Tsai说。
Tsai和Perry的研究小组利用遗传密码扩展技术，使基因组对人工信号敏感。在细胞系和小鼠胚胎的基因组中，研究人员插入一个扩展遗传密码的工具箱，该工具箱使Cas9（基因组编辑所需的酶）的表达依赖于赖氨酸衍生物Lys（Boc）的存在。这种非天然氨基酸是实现这一目的理想选择，因为它便宜、安全、容易获得，而且易于给细胞或整个动物注射。
研究人员们发现，Lys（Boc）的存在可以引发基因组编辑，而Lys缺失时则没有发生基因组编辑。Tsai和Perry设计的开关之所以成功，部分原因可能是在策略选择上:“我们的方法控制功能蛋白Cas9的翻译，而以前的方法则依赖于翻译后控制，如通过不同的刺激调节翻译出的蛋白的活性，”Tsai说。
基因驱动器是该成果在未来的应用之一，它可以确保所有的后代都将继承某些遗传变化，这些变化会在动物种群中迅速传播（例如，在畜群中）。由于效应是由诱导产生的，所以其力度控制更加安全。这种新的、可诱导的CRISPR开关可能更适合“在临床治疗性基因组进行原位编辑，或在环境兼容的控制中作为至关重要的基因驱动器”，Tsai说。
另一种分子开关类型具有人造酶特性，它是由一个瑞士合作团队开发的。这个团队由分子系统工程NCCR（国家研究能力中心）的主任 Tom Ward领导，它最初是由巴塞尔大学和苏黎世联邦理工学院（瑞士联邦理工学院）的研究人员启动的一个多学科协作计划。Ward的实验室联合了日内瓦大学有机化学系的Stefan Matile实验室和苏黎世联邦理工学院生物系统科学与工程学系的Martin Fussenegger实验室。团队基于他们各自在人工金属酶、细胞穿透性和合成基因开关方面的深厚积累，采用了模块化的设计策略。
这种新型的可穿透细胞的二硫键模块让人造金属酶在不伤害细胞的情况下进入细胞，Ward说，“让人联想到特洛伊木马”。进入后，酶催化一种能释放激素的反应。合成基因开关模块检测新释放的激素，并通过启动荧光指示剂——荧光素酶的表达进行响应。Ward说:“基因开关是由人造酶的非生物性的反应来开启的。”
现阶段的合作已经为他们的系统完成了概念验证(4)，他们正在积极地推动生物医学应用，包括与宿主蛋白的相互作用。例如，一种由癌细胞表达的能够实现精确定位的蛋白。“碳酸酐酶在许多癌细胞的表面过表达。” Ward说: “我们可以利用这种蛋白质在癌细胞表面或内部积累人工金属酶；只有当人工金属酶与碳酸酐酶结合时，系统才会启动。”
新一代表达系统
基因表达的分子调控技术的进步也为蛋白质表达系统的优化提供了更多的机会。随着药物制造商寻找更便宜的方式来表达新的生物药物，新一代表达系统的发展得到大力的推动。目前，标准的表达系统是来自哺乳动物的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系。然而，CHO细胞的局限性——如成本高和相对较慢的生长速度——使得新一代系统在表达新的生物药物方面有其竞争力，尤其是在助力降低重要药物的成本方面。
例如，AbSci公司的SoluPro蛋白表达平台可以在极高的滴度下生成可溶的、正确折叠的蛋白，目前可以使用大肠杆菌表达4g/L全长抗体和超过20g/L其他复杂产物。通常来说，一些人类蛋白不能在大肠杆菌中表达，需要哺乳动物细胞系进行正确的折叠。AbSci的技术包括两项创新，这两项创新使得在大肠杆菌中生产这种蛋白质成为可能，同时利用了这种表达系统的简单性和较低的成本。
一个创新是通过半碘化的细胞质，产生可溶性的、含二硫键连接的蛋白质。“细胞质生产通常会受到包涵体形成的限制，但其实它在其他方面是比较理想的，因为它的生产能力比周质生产高得多，对蛋白质大小没有限制。与基于分泌的表达系统相比，它的产生周期显著缩短到一两天。”AbSci的创始人和首席执行官Sean McClain说。第二个创新是SoluPro的双诱导启动子，可以独立控制。这使它能够“调整”蛋白质的生产速率，优化最佳的蛋白质折叠和滴度。
“SoluPro系统正确折叠蛋白质的能力克服了传统大肠杆菌表达的大部分限制，”McClain说。“我们已经成功地制造了比较难以生产的新型抗体骨架，以及IgG1和IgG4分子。”许多新型抗体骨架在研发过程中获得了越来越多的关注，但在CHO细胞中却很难生产。“AbSci非常关注这些传统技术难以生产，但是SoluPro非常适合高效生产的下一代抗体骨架，包括双特异性、Fc（可结晶片段）融合蛋白和其他多特异性产品，”他说。
Dyadic公司则提供了另一个新一代蛋白表达平台，即基于真菌的C1基因表达系统。Dyadic公司的研发人员利用了一项偶然发现的突变，使丝状耐热菌的蛋白质产量提高了100倍（该公司将其命名为“C1”）。他们目前专注于生物医学方面的推广，将C1表达平台应用于使生物疫苗和药物更便宜和易于获得。虽然丝状真菌听起来很奇特，但在本质上它们是天然的分泌者（C1的倍增时间是2小时，而CHO细胞需要大约20小时）。他们还使用了合成培养基，这进一步降低了成本，并且避免了CHO细胞所需的病毒灭活步骤。
据Dyadic首席执行官Mark Emalfarb说，如今CHO细胞等细胞系生产生物类似药的效率较低。Emalfarb说，“我们可以在三分之一的时间内多生产2到5倍的产品，并且只需要花费CHO培养基成本的一小部分（与报道的行业CHO平均生产率相比）。”因为C1会将其产物分泌到培养基中，所以下游的蛋白质收集步骤也比其他系统更简单。例如，大肠杆菌需要分解细胞，从细胞组分中提纯产物，这增加了复杂性和成本。
Dyadic公司的C1平台可高效生产全长单克隆抗体、重链和轻链抗体、fc-融合蛋白、fab（抗原结合片段）、双特异性抗体和疫苗。Emalfarb说：“我们还可以制造VLPs（类病毒颗粒），从理论上讲，这是一种更有效的疫苗，一般来说更难表达。我们现在甚至有一个分泌型的VLP，所以在下游处理过程中损失更少。”
Dyadic公司还工程化改造C1以对蛋白进行不同形式的人源化糖基化，以便制药公司对不同的糖基化蛋白进行评估。“与CHO细胞不同，C1细胞是单克隆细胞，”Dyadic首席商务官Matthew Jones解释道。“C1有潜力产生更一致、更同质的糖结构，供公司评估，以测试哪些糖结构可能更好用。”最近宣布与生物制药公司赛诺菲-安万特德国有限公司合作，将研究使用C1技术来表达不同类型的治疗性分子，如疫苗和基于蛋白质的生物制剂等。
基于大肠杆菌和酵母的表达系统都有某些的优点，比如不需要CHO细胞中昂贵的病毒清除步骤。此外，新一代表达系统的低成本反过来可以降低药物价格，同时允许药物制造商保持利润率，这激励制造商以更低的价格生产药物并将其提供给公众。McClain和Emalfarb都希望各自公司的技术能鼓励制药商销售对社会有益，而不只是有利可图的药物，比如成本更低但效果更好的新型流感疫苗。
如果没有操控表达系统的遗传学工具，这一切都不可能实现。随着科学家对基因组进行更精细的控制，表达产物的数量将会激增。而随着CRISPR/Cas9等基因组编辑工具的整合，新一代表达系统可能会达到进一步的表达水平记录。随着这些工具的不断完善，对患者的益处也将不断增加，并可能在这一过程中重塑生物医学行业。■
（译者李楠是365体育手机版：深圳先进技术研究院的副研究员。）
参考文献
1.B. Enghiad, H. Zhao, ACS Synth. Biol. 6, 752-757 (2017).
2.A. Lapinaite, J. A. Doudna, J. H. D. Cate, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 115, 3368-3373 (2018).
3.T. Suzuki et al., Sci. Rep. 8, 10051 (2018).
4.Y. Okamoto et al., Nature Comm. 9, 1943 (2018).
作者Caitlin Smith 是一位常驻俄勒冈州波特兰的自由科学作家。
鸣谢：“原文由美国科学促进会（www.aaas.org）发布在2018 年11月16 日《科学》杂志”。官方英文版请见https://www.sciencemag.org/features/2018/11/protein-expression-revisited。
《科学新闻》 (科学新闻2020年2月刊 科学·生命)